（一） 原理 標(biāo)記抗體法雖然具有許多優(yōu)點(diǎn)，但也存在一些難以克服的問題，如標(biāo)記抗體的分子增大，對細(xì)胞膜和組織的穿透力減弱；化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)對抗體和酶的活性有所影響；結(jié)合物中未標(biāo)記的抗體可與抗原競爭結(jié)合，影響檢測方法的敏感性等。不標(biāo)記抗體法可以避免上述的不利影響因素，通過一系統(tǒng)的非標(biāo)記抗體的免疫學(xué)反應(yīng)，對組織中的抗原進(jìn)行定位檢測。不標(biāo)記抗體法又可分為用標(biāo)記物顯示和不同標(biāo)記物顯示兩種方法。前者利用基因工程方法制備雙特異性抗體的F（ab′）2，一個(gè)Fab片段與標(biāo)本中的抗原結(jié)合，一個(gè)Fab是抗體蛋白的結(jié)合片段。在抗體與標(biāo)本作用后，再加入鐵蛋白與抗體結(jié)合，從而顯示組織內(nèi)抗原的所在部位。后者則用磷酸鎢負(fù)染后，直接電鏡觀察。 （二）材料及試劑 1．待檢病毒材料 如糞便，氣管分泌物、腦脊髓液、組織培養(yǎng)液等。 2．高速離心機(jī) 3．已知抗體 4．磷鎢酸 5．瓊脂糖 6．其它 （三）操作方法 1．經(jīng)典法 （1）將被檢病毒材料0.9ml，加1︰5～1︰10稀釋的特異性免疫血清0.1ml充分混合。 （2）置37℃作用1h或37℃1h后再置4℃過夜。 （3）以17 000r/min～23 000r/min離心90min。 （4）吸去上清，將離心管口倒置于濾紙上，吸去殘留液體。 （5）沉淀物中加少量H2O混懸，用3%磷鎢酸（pH6.0）負(fù)染20Sec～30Sec，滴加于400目銅網(wǎng)Fomnvar膜上，用濾紙從銅網(wǎng)邊緣輕輕吸去多余的負(fù)染液。 （6）在透射電鏡下4×104倍觀察。 2．快速法（瓊脂擴(kuò)散法） （1）同經(jīng)典法（1）、（2）步驟，制備免疫復(fù)合物。 （2）以生理鹽水或pH 7.2巴比妥緩沖液制備1%瓊脂糖，趁熱澆注于潔凈的載玻片上，每片3ml，待冷卻凝固后，在凝膠面上等距離放置直徑4mm玻璃珠數(shù)粒，再于凝膠面上澆注1%瓊脂糖2ml～3ml，冷卻凝固后，取出玻璃珠，使凝膠形成凹孔。 （3）將普通濾紙剪成2×3cm大小，3～4層重疊。用小刀將帶有凹孔的瓊脂糖切成小塊,每塊帶有一個(gè)凹孔,平放在濾紙上。 （4）在凹孔內(nèi)，加入制備好的含病毒的免疫復(fù)合物懸液。 （5）將電鏡載網(wǎng)的Fomnvar膜面向下倒懸于液滴上。由于瓊脂糖的吸水作用，20min～30min后，可將液滴的水分吸干，而濃縮的免疫復(fù)合物則粘附在載網(wǎng)膜上。 （6）在載網(wǎng)膜上滴加3%磷鎢酸負(fù)染20Sec，過量的負(fù)染液用濾紙?jiān)谳d網(wǎng)邊緣輕輕吸去。 （7）于透射電鏡4×104倍下觀察。 （四）結(jié)果判定 直接觀察病毒粒子的形態(tài)。由于離心濃縮的處理和特異性抗體的加入，大大提高了觀察的敏感性。 |
