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本試劑盒僅供研究研究使用
預期應用
ELISA法定量測定人血清、血漿、唾液、細胞培養(yǎng)物上清或其它相關(guān)液體中MMP-9含量。
概述
    MMP-9基因位于染色體20q11.1~13.1，26~27kbp，具有13個外顯子和9個內(nèi)含子。哺乳類動物MMP-9mRNA的同源性約為80%。MMP-9的啟動子區(qū)內(nèi)含有活化蛋白（AP）-1、AP-2和刺激蛋白（SP）-1因子結(jié)合位點，人的MMP-9啟動子區(qū)還有核因子（NF）κB、ETS結(jié)合位點和轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β抑制元件MMPs主要由3個*的、保守的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，包括前肽區(qū)（氨基末端區(qū)）、催化區(qū)和羧基末端區(qū)（類血紅素結(jié)合蛋白酶區(qū)）。MMP-9是明膠酶中的一種，除了有MMPs的原型結(jié)構(gòu)外，MMP-9的催化區(qū)還包括3個重復的型纖維連接蛋白結(jié)構(gòu)域，這個結(jié)構(gòu)域與明膠或彈性蛋白有高度的親和力。MMP-9包含一個V型的膠原蛋白結(jié)構(gòu)域,這個結(jié)構(gòu)域有高度的糖基化作用，,它影響底物的特異性以及有抗衰變的作用。MMP-9有許多作用底物，如Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ型膠原、蛋白聚糖的核心蛋白、明膠、纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白等，細胞因子及其受體也是MMP-9作用的底物。
實驗原理
本試劑盒應用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中MMP-9水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入MMP-9抗原、生物素化的抗人MMP-9抗體、HRP標記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的MMP-9呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
試劑盒組成
1.酶聯(lián)板：一塊（96孔）
2.標準品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，其濃度為100 ng/mL，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成100 ng/mL，50 ng/mL ，25 ng/mL，12.5 ng/mL，6.3ng/mL，3.1 ng/mL，1.6 ng/mL，其原液直接作為zui高標準濃度，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 ng/mL，臨用前15分鐘內(nèi)配制。
3.樣品稀釋液：1×20ml/瓶。
4.檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。
5.檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。
6.檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A1：100稀釋。
7.檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋。
8.底物溶液：1×10ml/瓶。
9.濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10.終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
標本的采集及保存
1．細胞培養(yǎng)物上清：請離心后收集上清，并將標本保存于-20℃，且應避免反復凍融。
2．血清：標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?20℃保存，但應避免反復凍融。
3．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)吮痉庞?20℃保存，但應避免反復凍融。
注：標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
操作步驟
各試劑在使用前平衡至室溫。
1.加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。除空白孔外，余孔分別加標準溶液或待測樣品100ul，輕輕混勻，37℃，120分鐘。
2.棄去液體，甩干，不用洗滌。
3.每孔加檢測溶液A工作液 100ul，37℃,60分鐘。洗板3次，350ul/每孔，甩干。
4.每孔加檢測溶液B工作液 100ul，37℃，60分鐘，洗板5次，甩干。
5.依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色30分鐘。
6.依序每孔加終止溶液50ul，終止反應。用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。
注：
1． 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。
2．為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層
吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要，重復此過程數(shù)次。
    自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
特異性
    本試劑盒可同時檢測重組或天然的人MMP-9，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應。
計算
  以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
注意事項
1．洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
2．一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
3．請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。
4．如標本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。
5．在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。
6．底物請避光保存。 
說明
1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。
2．有效期：6個月
3．濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
4．中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。