1. 酶聯(lián)板（Assay plate ）：一塊（96 孔）。
2. 標準品（Standard）：2瓶（凍干品）。
3. 樣品稀釋液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶。
4. 生物素標記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶。
5. 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液（HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶。
6. 生物素標記抗體（Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100）
7. 辣根過氧化物酶標記親和素（HRP-avidin）：1×120μl/瓶（1：100）
8. 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。
9. 濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25 倍。
10. 終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
1. 標準規(guī)格酶標儀
2. 高速離心機
3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱
4. 干凈的試管和Eppendof 管
5. 系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器
6. 蒸餾水，容量瓶等
1. 血清：全血標本請于室溫放置2 小時或4℃過夜后于1000g 離心20 分鐘，取上清即可
2. 血漿：可用EDTA 或肝素作為抗凝劑，標本采集后30 分鐘內(nèi)于2 - 8°C 1000 g 離心15
3. 細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：1000g 離心20 分鐘，取上清即可檢測，或?qū)吮痉?/div>
于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復凍融。
注：標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
標本的稀釋原則：
首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標準
曲線的范圍內(nèi)，檢測的結(jié)果才是準確的。稀釋的過程中，應(yīng)做好詳細的記錄。zui后計算濃度
時，稀釋了“N”倍，標本的濃度應(yīng)再乘以“N”。
標準品的稀釋原則：2 瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，
然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為5000 ng/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋5000
ng/ml，2500 ng/ml，1250 ng/ml，625 ng/ml，312 ng/ml，156 ng/ml，78 ng/ml，樣品稀釋液
直接作為標準濃度0 ng/ml，臨用前15 分鐘內(nèi)配制。
如配制2500 ng/ml 標準品：取0.5ml（不要少于0.5ml）5000 ng/ml 的上述標準品加入含0.5ml
樣品稀釋液的Eppendorf 管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
生物素標記抗體的稀釋原則：
臨用前以生物素標記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制
（每孔100μl），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl 生物素標記抗體加990μl 生物素標
記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。
辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則：
臨用前以辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的
總量配制（每孔100μl），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl 辣根過氧化物酶標記親和
素加990μl 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)
配制。
操作步驟
實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。
每次檢測都應(yīng)該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試
劑盒的檢測范圍。
1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，余孔分別加
標準品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸
及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120 分鐘。
為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標記抗體工作液 100μl（取1μl 生物素標記
抗體加99μl 生物素標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制），
37℃,60 分鐘。
3. 溫育60 分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3 次，每次浸泡1-2 分鐘，200μl/每孔，甩
干。
4. 每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液（同生物素標記抗體工作液） 100μl，37℃，
60 分鐘。
5. 溫育60 分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5 次，每次浸泡1-2 分鐘，200μl/每孔，甩
干。
6. 依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30 分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標準品的前3-4
孔有明顯的梯度藍色，后3-4 孔顯色不明顯，即可終止）。
7. 依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量
與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入
終止液。
8. 用酶聯(lián)儀在450nm 波長依序測量各孔的光密度（OD 值）。在加終止液后15 分鐘以內(nèi)
進行檢測。
注：
1. 用戶在初次使用試劑盒時，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。
2. 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。
測量時先用此孔調(diào)OD 值至零。
3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標板加上蓋或覆膜。
4. 未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8℃保存。標準品、生物素標記抗體工作液、辣根過
氧化物酶標記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復使用已稀釋過的標準
品、生物素標記抗體工作液、或辣根過氧化物酶標記親和素工作液。
5. 建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準確性。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，
酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml 注入孔內(nèi)，浸泡1-2 分鐘。根據(jù)需
要，重復此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
計算
以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標），OD 值為縱坐標（普通坐標），在半對數(shù)坐標紙上繪
出標準曲線，根據(jù)樣品的OD 值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物
的濃度與OD 值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值代入方程式，計算出樣
品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
注意事項
1. 當混合蛋白溶液時應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。
2. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
3. 一次加樣時間控制在5 分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4. 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。
5. 如標本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。
6. 在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。
7. 底物請避光保存。
8. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。
